ARTUR GÓRA, PH.D.

Projekt: REDEHAL - Zdokonalování haloalkán dehalogenáz modifikací vstupních tunelů

Školitel: doc.Mgr.Jiří Dambovský, Dr.

Hostitelská instituce: Loschmidt laboratories, Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta MU

Země původu: Polsko 

Země vědeckého působení: Japonsko

Délka projektu: 36 měsíců

Panel: Life sciences

Abstrakt:

Metody proteinového inženýrství, racionálního re-designu nebo de novo designu hrají důležitou roli v moderním chemickém a farmakologickém průmyslu. Tento projekt bude zkoumat vliv re-inženýrství tunelů enzymů halogenalkan dehalogenas na jejich aktivitu a selektivitu s cílovými substráty. Novost navrhovaného projektu spočívá v inženýrství katalytických vlastností enzymů úpravou přístupových tunelů, představující nový koncept potenciálně platný pro ostatní enzymy se skrytým aktivním místem. Kombinace výpočetních a experimentálních metod umožní získat profil volné energie a bariéry průchodu molekul vody, substrátů a produktů přístupovým tunelem. Získané informace poskytnou nový pohled na úlohu vody jako rozpouštědla v katalytickém mechanismu enzymů. Pochopení těchto mechanismů rozšíří naše základní znalosti enzymové katalýzy, které jsou důležité jak v základním, tak v aplikovaném výzkumu. Na základě provedené analýzy bude možné navrhovat nové mutanty halogenalkan dehalogenas s lepšími katalytickými vlastnostmi. Pro studium přístupu nových ligandů budou vyvinuty výpočetních metody s cílem zpřesnit předpovědi tunelů pro re-inženýrství enzymů s požadovanou selektivitou a aktivitou.

Dosavadní průběh projektu:

Projekt REDEHAL zkoumá možnost inženýrství tunelů bakteriálních enzymů halogenalkandehalogenas. Novost projektu spočívá ve zlepšení katalytických vlastností enzymů úpravou přístupových tunelů. Kombinace výpočetních a experimentálních metod poskytne detailní popis překážek pro průchod molekul vody, substrátů a produktů prostřednictvím přístupových tunelů. Metody poskytnou nový pohled na roli interakcí solventu s tunelem v katalytickém mechanismu enzymů a pomohou určit další limitace v procesu enzymatické katalýzy. Pochopení těchto mechanismů rozšíří naše základní znalosti v oblasti biokatalýzy, která jsou zajímavé jak z pohledu základního výzkumu tak praktických aplikací. Na základě provedené analýzy bude možné navrhovat nové enzymy s vylepšenými katalytickými vlastnostmi. Pro studium přístupu ligandu do aktivního místa budou vyvinuty nové výpočetní metody, které umožní inženýrství enzymů s požadovanou selektivitou a aktivitou.

Celkové cíle projektu jsou: 
• rozvíjet rychlé a přesné in silico metody pro tvorbu mutantů s požadovanou účinností a selektivitou • navrhnout strukturu mutantů s požadovanými vlastnostmi a jejich experimentální ověření

Aktivity realizované v rámci projektu (první rok):

•  školení v oblasti molekulárního modelování, vizualizace a molekulárních bioinformačních nástrojů (Amber, AutoDock, Pymol, FOLDX, HotSpot Wizard, CAVER)
• účast na vývoji softwaru (CAVER plug-in a CAVER 3.0),
• popis halogenalkandehalogenas a jiných struktur enzymů se zaměřením na popis jejich tunelů
• spolupráce s experimentální skupinou (analýza a vysvětlení experimentálních výsledků, které poskytují vstupní data pro návrh nových enzymů).

Stručné shrnutí hlavních výsledků získaných k dnešnímu dni:

• Predikce tunelů v halogenalkandehalogenase DatA
• Návrh dvou jednobodových mutantů DatA F178A a DatA F247A tak, aby měly více otevřený přístupový tunelu. Predikované mutanty byly zkonstruovány a jsou v současné době v experimentálním ověřování.
• Predikce uzavření tunelu v halogenalkandehalogenáze LinB
  Dvě samostatné bodové mutace A247C a D147C byly navrženy v blízkosti přístupového tunelu tak, aby vytvořily disulfidický můstek s dříve navrženým L177C LinB mutantem. Navržené mutanty byly zkonstruovány a jsou v současné době v experimentálním ověřování. 

Detekce zbytků tunelu ve vybraných enzymech - vstupní data pro testování hypotézy o stabilizačním účinku mutací tunelových reziduí

 

Výsledkem dosažených výstupů projektu je: 

• urychlení prací na vývoji nových (CAVER 3,0) a zlepšení již existujících, široce používaných softwarů (CAVER plug-in pro PyMol),
• zlepšení vědeckého potenciálu hostitelské skupiny transferem znalostí
• ,navrhování nových možných zajímavých mutantů halogenalkandehalogenas, enzymů s potenciální použitelností v průmyslu a ochraně životního prostředí 
• účast na přípravě patentu: "Zlepšení stability proteinů, při vyšších teplotách a za přítomnosti organických rozpouštědel inženýrstvím tunelů a kanálů"