RU EN CS

Yuh-Man Sun, Ph.D.

Projekt: NEURALDEVESTEM - Objasnění role a molekulárního mechanismu působení Neuronatinu (NNAT) v neurální indukci lidských embryonálních kmenových buněk

Školitel: prof. Ing. Petr Dvořák, CSc.

Hostitelská instituce: Biologický ústav, Lékařská fakulta MU

Země původu: Taiwan/UK

Země vědeckého působení: Jihoafrická republika, Velká Británie

Délka projektu: 24 měsíců

Panel: Life sciences

Abstrakt:

Jak je vytvářen mozek? Tato otázka láká nejen vývojové biology, ale i oblast biomedicíny, která se zabývá vývojem terapeutických přístupů k léčbě onemocnění spjatých s mozkem. Prvním krokem vývoje centrální nervové soustavy je neurální indukce, resp. vývoj neurálních kmenových buněk (NSC – neural stem cells). Obecná koncepce neurální indukce předpokládá, že při nepřítomnosti vnějších inhibitorů (např. BMP signálování) ektodermální buňky automaticky nastupují neurální diferenciaci. Dodnes se vlastně neví, zda to platí. Objevují se však stále nové důkazy poukazující na to, že k navození neurální indukce nestačí pouze inhibovat BMP signálování, ale musí být i aktivována FGF/Erk dráha, jež pak působí autokrinně či parakrinně. Prvotní experimenty Spemanna a Mangoldové z roku 1924 ukazují, že neurální indukce je řízena vnějšími faktory. Existují však i nějaké faktory vnitřní? Mají na neurální indukci rozhodující vliv?
Na tyto otázky musíme nalézt odpověď. Naše skupina nedávno objevila nový vnitřní regulátor Neuronatin (Nnat), který u myších embryonálních kmenových (ES – embryonic stem) buněk zahajuje neurální indukci a také podporuje neuralizaci u embryí Xenopus. Tento projekt si klade za cíl objasnění úlohy a mechanismu působení NNAT při neurální indukci lidských ES buněk. Odhalení mechanismu neurální specifikace tak pomůže získat čistší a lépe definovanou populaci NSC z indukovaných pluripotentních (iPS – induced pluripotent stem) buněk, které jsou úzce spjaty s terapiemi využívajícími kmenové buňky.

 Dosavadní průběh projektu:

Mé cíle jsou následující:

  1. Vytvoření modelu neurální diferenciace u lidských embryonálních kmenových buněk (hESCs).
  2. Získání expresního modelu NNAT během neurální diferenciace lidských embryonálních buněk.
  3. Vytvoření hESCs linií se sníženou (NNAT-KD) a zvýšenou (NNAT-OE) expresí NNAT.
  4. Charakterizace fenotypů NNAT-KD a NNAT-OE hESCs linií během neurodiferenciace.
  5. Objasnění mechanismu účinku NNAT prostřednictvím interakce SERCA2 a Ca2+ signálování.
  6. Určení role BMP4 a FGF dráhy na neurální diferenciaci zprostředkovanou NNAT.

Výsledky tohoto projektu nám objasní, zda NNAT působí jako iniciátor neurální indukce u hESCs a zda je toto způsobeno prostřednictvím Ca2+ signálování a ovlivňováno dráhami BMP4 a FGF.

Stručné shrnutí aktivit, které byly v rámci projektu realizovány za příslušné období od začátku projektu:

Před zahájením mého projektu jsem strávila první měsíc osvojením si dovedností souvisejících s kultivací lidských embryonálních buněk (hESCs). Mezi tyto aktivity patří nasazení podpůrné vrstvy myších fibroblastů (feeder), příprava a aplikace Matrigelu na kultivační misky, pasážování a zamrazení hESCs. V rámci této praxe jsem dospěla ke zjištění, že lidské embryonální buňky (hESCs) se chovají velmi odlišně v porovnání s myšími embryonálními buňkami (mESCs). Proto jsem se dlouze zabývala vytvořením nového modelu pro neurální diferenciaci u hESCs, což je první cíl mého projektu.

Diferenciace hESCs na neurony nakonec trvala třikrát déle v porovnání s neurodiferenciací navozenou u mESCs. Jakmile byl nastaven model neurální diferenciace u hESCs, zjišťovala jsem expresní profil NNAT genu a proteinu během neurodiferenciace za pomoci metod real-time PCR a imunocytochemické analýzy. Dále jsem navrhla a vytvořila NNAT-overexpresní vektory fúzované s eGFP proteinem. Následně jsem připravila stabilně transfekované NNAT-mutantní linie hESCs (NNAT-KD a NNAT-OE linie), které jsou v současné době testovány. Navíc jsem za použití technologie Duolink zjistila, že NNAT strukturálně interaguje s SERCA2.

V rámci dodržení závazku SoMoPro projektu (tj. dohled nad doktorandy a získání další finanční podpory na výzkum) jsem vytvořila vedlejší projekt související s hlavním projektem SoMoPro, přičemž tento projekt probíhá velmi dobře a je prováděn postgraduálními studenty pod mým dohledem. Jako hlavní autor připravuji výsledky pro zveřejnění, přičemž tato publikace bude obsahovat informaci o poskytnutí financování z projektu SoMoPro. Během jednoho roku se moje skupina velmi rychle rozšířila a v současné době jsou jejími členy 1 postdok, 1 technik, 3 postgraduální studenti a 1 studentka magisterského studijního programu. Tyto aktivity poukazují na mou snahu o přispění ke vzdělávání studentů na Masarykově univerzitě. Navíc se snažím zajistit více prostředků na výzkum, proto jsem se podílela na podání žádosti u FP7 EU, která zajišťuje financování vědeckých projektů společně s 15 dalšími institucemi po celém světě. Také spolupracuji s prof. Tomášem Kašpárkem z CEITEC-MU a dále s tchajwanskými vědci, Dr. Hsuan-hwai Lin, abych mohla případně požádat o IGA  a GAČR bilaterální granty.

Stručné shrnutí doposud dosažených výsledků:

  1. Vytvoření modelu neurální diferenciace u lidských kmenových buněk (hESCs).
  1. Zavedení protokolu pro neurální diferenciaci lidských kmenových buněk přes neurální kmenové buňky (NSC) k neuronům.
  2. Definování časových posloupností tvorby neurálních kmenových buněk a neuronů během neurodiferenciace, což je důležité pro zjištění hlavního mechanismu účinku NNAT  na neurální diferenciaci.
  1. Získání NNAT expresního profilu během neurodiferenciace lidských embryonálních buněk
  2. Vytvoření NNAT/GFP fúzních vektorů.
  3. Vytvoření hESCs linií se sníženou expresí NNAT (NNAT-knockdown).
  4. Vytvoření hESCs linií se zvýšenou expresí NNAT (NNAT-overexprese).
  5. Potvrzení strukturální interakce proteinů NNAT a SERCA2.
  6. vytvoření skupiny 6 spolupracovníků (3 postgraduální studenti, 1 postdok, 1technik, 1 studentka magisterského oboru).
  7. Získání dostatečného množství výsledků pro přípravu publikace.
  8. Příprava 4 návrhů o financování mého výzkumu.

Shrnutí předpokládaných výstupů projektu a jejich potenciálních dopad a využití:

Pevně věřím, že na konci projektu SoMoPro budou výsledky z něj získané publikovány v některém z vysoce impaktovaných časopisů. Výsledky tohoto projektu budou dokazovat, že Nnat/NNAT je nově objeveným regulátorem v procesu neurální indukce u myšího i lidského mozku. Koncept neurodiferenciace odvozený z tohoto výzkumu zásadně změní myšlení lidí v tom, jakým způsobem probíhá neurální indukce u savců. Tento projekt poskytne novou dimenzi v pochopení základních mechanismů neurální indukce. Díky tomuto projektu vznikly další dva související vedlejší projekty, kterými se zabývají dva postgraduální studenti. Na konferenci ISSCR konané v Japonsku od 13. 6. – 16. 6. 2012 představím poster, který bude obsahovat výsledky těchto vedlejších projektů. Navíc, v rámci jednoho z těchto projektů byla získána natolik významná data, že připravuji publikaci pro časopis s vysokým impakt faktorem.

 

Spojujeme studenty, učitele, vědce i ty, kdo chtějí své know-how předat dál. Vytváříme síť lidí zapojených do studia nebo práce v oblasti přírodovědy a techniky.

Více

Podpořte nás na sociálních sítích

Facebook Twitter Google + Linkedin